基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此基因克隆又稱DNA克隆、分子克隆、基因重組或重組DNA技術(shù)。

      基因克隆涉及一系列的分子生物學(xué)技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等。為了方便大家學(xué)習(xí)和交流，我以問答形式介紹基因克隆及其常見問題，希望對大家有所幫助。

    Q1：如何獲取一個已知基因的序列？

A1：對已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡便的一種。獲取基因序列多從文獻中查取，即將別人報道的基因序列直接作為自己DNA克隆的依據(jù)。目前，世界上主要的基因庫有：

(1)EMBL，為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實驗室的基因庫；

(2)Genbank，為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫

(3)Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫，其所含序列的準確度比較高，而TREMBL只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。

目前，以Genbank的應(yīng)用最頻繁。

    Q2：什么基因克隆法（Shotgun Cloning）？

A2：該方法是隨機切割供體基因組DNA ，再轉(zhuǎn)化到受體基因組中，根據(jù)對轉(zhuǎn)化子的表型鑒定，然后找出所需克隆的基因，基因克隆戰(zhàn)略成功地應(yīng)用于分離細菌的無毒基因。Staskawica B. J .等利用這一策略，從大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的無毒基因。但是在高等植物中，由于基因組很大，因而應(yīng)用這種方法進行基因克隆非常困難。例如，如果將此方法應(yīng)用于番茄的抗病基因篩選，需要以雙元載體構(gòu)建抗病品種的基因文庫，然后通過農(nóng)桿菌等將它們導(dǎo)入感病品種之中，然后篩選抗病轉(zhuǎn)化體來分離抗病基因。但這樣鑒定一個單拷貝的基因，需要篩選105株轉(zhuǎn)基因植株，工作量非常大。

    Q3：什么是TA基因克隆方法（Original TA Cloning Kit）?

A3：利用聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴增產(chǎn)物的3’端自動添加一個3’-A突出端。然后利用一個線性含3’-T突出端的載體舊可以直接高效地連接PCR產(chǎn)物。所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將PCR產(chǎn)物進行優(yōu)化，不需把PCR產(chǎn)物做平端處理，不需在PCR擴增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進行基因克隆。

    Q4：基因克隆時選擇連接酶的原則？

A4：體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是常選的酶，因其能在正常的反應(yīng)條件下有效的將平端連接起來。

   Q5：基因克隆時選擇內(nèi)切酶時的注意事項？

A5：在基因克隆設(shè)計時盡量使用好切的內(nèi)切酶，通常是效價高、便宜量大的酶，且注意這兩個酶有比較兼容的Buffer，即在這種公用Buffer中，兩酶的效力變化不大，至少保持60%的活性。

    Q6：如何在基因克隆實驗中檢驗酶切是否*?

A6：根據(jù)酶切產(chǎn)物大小評判。例如原來的重組質(zhì)粒是3000 bp，酶切后，跑出來兩條少于3000 bp的條帶，就說明酶切*了，如果不*的話電泳還會跑出3000 bp的條帶。

    Q7：低產(chǎn)量或無轉(zhuǎn)化子的原因?

A7：可能有以下幾個原因：

(1)  轉(zhuǎn)化效率低。這可能是由于大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率低或者大腸桿菌無法忍受克隆序列引起，還有可能是電轉(zhuǎn)化前未除去連接酶和/或PEG，連接酶沒有熱失活，連接酶反應(yīng)的連接酶過量等原因引起轉(zhuǎn)化效率低

(2)  DNA質(zhì)量低。DNA含有污染或者凝膠切割回收時，DNA被UV光損害

(3)  DNA末端不匹配。在選擇限制酶時匹配不正確或者是載體和插入片段未磷酸化，PCR產(chǎn)物切割效率低，克隆時使用的工具酶受到污染等。

(4)  空載體。載體自身環(huán)化切割不*造成。

(5)  結(jié)構(gòu)不正確。非特異性PCR產(chǎn)物克隆，或者由于內(nèi)切或外切核酸酶污染使得插入片段斷裂。

(6)  克隆的插入片段序列錯誤。PCR使用的DNA聚合酶保真性低，凝膠切割回收時DNA被UV光損害，PCR引物錯誤。

(7)  克隆不含質(zhì)粒。瓊脂培養(yǎng)基中抗生素含量不夠或者衛(wèi)星克隆。

    Q8：怎樣挑選陽性重組DNA？

A8：1、將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細菌能在培養(yǎng)基上生長形成單菌落；2、酶切鑒定：挑取的初步陽性克隆菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，純化質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。如果酶切出來有兩條帶，其中一條和目的基因長度相似，另一條帶與質(zhì)粒大小相似，則二次鑒定為陽性克??；3、最后，將重組質(zhì)粒送檢測序，如果能得到目的基因序列，則最終確定重組成功。

    Q9：基因克隆中質(zhì)粒DNA的小量制備？

A9：常見的質(zhì)粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。常用的為堿裂解法，原理是：在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH值調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。目前，SunShineBio的商品化質(zhì)粒小量提取試劑盒可以幫助您回收高質(zhì)量、高效率的質(zhì)粒。

    Q10：基因克隆實驗中所需試劑？

A10：1、PCR基因擴增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀；電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動成像儀。

2、三角燒瓶，培養(yǎng)皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。

3、微量加樣器；Tip頭；Tip頭盒；Eppendorff管；Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。

4、DNA重組相關(guān)試劑：

(1).Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：感受態(tài)細胞；氨芐青霉素（100mg/ml）。

(2).LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，10N NaOH調(diào)pH至7.0定容至1 L。15磅高壓消毒，4 ℃保存。

(3).LB瓊脂培養(yǎng)基：15 g瓊脂粉溶于1000 ml LB培養(yǎng)基，15磅高壓消毒備用。

5．質(zhì)粒提取試劑或者質(zhì)粒提取試劑盒：

溶液Ⅰ(10×)：0.5 M葡萄糖；0.25 M Tris-Cl (pH8.0)；0.1 M EDTA，10磅高壓消毒，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

溶液Ⅱ：0.2M NaOH；1% SDS 室溫貯存，即用即配。

溶液Ⅲ：3M NaOAc (pH4.8) 10磅高壓消毒，室溫貯存。

RNA酶 A：10 mg/ml

TE緩沖液：10 mM Tris-Cl (pH7.6)，1 mM EDTA(pH8.0)

6．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑：SunShineBio即用緩沖液；限制性內(nèi)切酶及酶反應(yīng)所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10 mg/ml）；6×載樣緩沖液。

50×Tris-乙酸(TAE)貯存液：242 g Tris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）加水至1 L。

Q11：基因克隆實驗中SunShineBio可以提供哪些試劑產(chǎn)品

A11：（1） 核酸試劑盒：SunShineBio質(zhì)粒小量抽提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、電泳Marker。（2）生化試劑及即用試劑：1 M Tris-HCl（pH8.0）、10×TAE Buffer、5×TBE Buffer、EB染料、6×Surcose DNA Loading Buffer、瓊脂、氨芐青霉素、Tris Base等。