一、引言

基因治療作為一種新興的治療策略，在治療多種遺傳性和獲得性疾病方面展現(xiàn)出巨大的潛力。其中，安全高效的基因載體是基因治療成功的關鍵因素之一。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性、潛在的致瘤性等嚴重問題。非病毒載體，如脂質(zhì)體和聚合物納米粒，由于其低免疫原性和易于合成等優(yōu)點受到廣泛關注。

硅納米材料因其良好的生物相容性、易于表面修飾等特點，在生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用前景。多聚賴氨酸是一種具有良好生物相容性且?guī)д姾傻木酆衔?，能夠與帶負電荷的核酸分子通過靜電相互作用結合。將多聚賴氨酸與硅納米材料結合，可以制備出一種新型的納米載體，有望實現(xiàn)高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染。本研究聚焦于多聚賴氨酸硅納米載體的制備及其體外細胞轉(zhuǎn)染性能的研究，旨在為基因治療載體的發(fā)展提供新的思路和方法。

二、材料與方法

（一）材料

化學試劑
正硅酸乙酯（TEOS）、3 - 氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、多聚賴氨酸（PLL，不同分子量）、熒光標記的質(zhì)粒 DNA（如綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒，pEGFP - N1）、細胞培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶 - EDTA 溶液、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS）等。

細胞系
選用常用的體外細胞模型，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞）或 293T 細胞（人胚腎細胞）。

（二）多聚賴氨酸硅納米粒子的制備

硅納米粒子的合成
采用經(jīng)典的 St?ber 法合成硅納米粒子。在乙醇 - 水混合溶液中，加入氨水作為催化劑，緩慢滴加 TEOS。反應方程式如下：

反應在室溫下攪拌一定時間（如 2 - 4 小時），通過離心收集硅納米粒子，并用乙醇多次洗滌以去除雜質(zhì)。

硅納米粒子的氨基化
將合成的硅納米粒子分散于甲苯中，加入 APTES，在氮氣保護下加熱回流反應。APTES 的氨基與硅納米粒子表面的羥基發(fā)生反應，使硅納米粒子表面帶有氨基。反應式為：

反應結束后，離心收集氨基化硅納米粒子，并用甲苯和乙醇依次洗滌。

多聚賴氨酸的偶聯(lián)
將氨基化硅納米粒子分散于 PBS 中，加入不同濃度的多聚賴氨酸溶液，在室溫下攪拌反應一定時間（如 12 - 24 小時）。多聚賴氨酸的氨基與氨基化硅納米粒子表面的氨基通過交聯(lián)劑（如戊二醛）進行共價偶聯(lián)。反應式為：

反應完成后，通過離心收集多聚賴氨酸硅納米粒子，并用 PBS 多次洗滌以去除未反應的多聚賴氨酸。

（三）多聚賴氨酸硅納米粒子的表征

粒徑與電位測定
采用動態(tài)光散射（DLS）技術測定多聚賴氨酸硅納米粒子的粒徑大小和表面電位。將納米粒子分散于 PBS 中，在合適的測量角度和溫度下進行測量。粒徑的大小影響納米粒子在細胞內(nèi)的攝取和分布，表面電位則與納米粒子與細胞的相互作用以及與核酸的結合能力密切相關。

形態(tài)觀察
利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察多聚賴氨酸硅納米粒子的形態(tài)。將納米粒子分散于乙醇溶液中，滴加在銅網(wǎng)上，干燥后在 TEM 下觀察。TEM 圖像可以直觀地顯示納米粒子的形狀、大小和分散性。

紅外光譜分析
采用傅里葉變換紅外光譜（FT - IR）分析多聚賴氨酸硅納米粒子的化學結構。通過比較納米粒子在偶聯(lián)前后的紅外光譜圖，可以確定多聚賴氨酸是否成功偶聯(lián)到硅納米粒子上。例如，多聚賴氨酸的特征吸收峰（如酰胺鍵的吸收峰）在偶聯(lián)后的納米粒子光譜中出現(xiàn)，可作為成功偶聯(lián)的證據(jù)。

（四）體外細胞轉(zhuǎn)染實驗

細胞培養(yǎng)
將 HeLa 細胞或 293T 細胞接種于培養(yǎng)皿中，在含有 10% FBS 和 1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，于 37°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至合適密度（如 70 - 80% 匯合度）時，用于轉(zhuǎn)染實驗。

轉(zhuǎn)染實驗分組
設置不同的轉(zhuǎn)染組，包括空白對照組（只加細胞和培養(yǎng)基）、陽性對照組（使用已知的高效轉(zhuǎn)染試劑，如 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 DNA）、不同濃度的多聚賴氨酸硅納米粒子轉(zhuǎn)染組（如含有不同質(zhì)量濃度的納米粒子與固定量的質(zhì)粒 DNA 混合）。

轉(zhuǎn)染過程
將多聚賴氨酸硅納米粒子與熒光標記的質(zhì)粒 DNA 按照一定比例（如質(zhì)量比為 1:1 - 10:1）在 PBS 中混合，室溫下孵育一定時間（如 30 分鐘），使納米粒子與質(zhì)粒 DNA 充分結合形成復合物。然后將復合物加入到細胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（如 4 - 6 小時）。之后，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 - 48 小時。

轉(zhuǎn)染效率檢測
采用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)的綠色熒光蛋白表達情況，計算轉(zhuǎn)染效率。隨機選取多個視野，統(tǒng)計熒光陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例。同時，利用流式細胞術進一步定量分析轉(zhuǎn)染效率，通過檢測細胞的熒光強度來確定轉(zhuǎn)染細胞的比例。

細胞毒性評價
采用 MTT 法評價多聚賴氨酸硅納米粒子的細胞毒性。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（如 24、48、72 小時），向細胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時。然后吸出培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結晶物，在酶標儀上測定 570nm 處的吸光度值。細胞存活率計算公式為：細胞存活率處理組吸光度值對照組吸光度值

三、結果與討論

（一）多聚賴氨酸硅納米粒子的表征結果

粒徑與電位
DLS 測量結果顯示，制備的多聚賴氨酸硅納米粒子粒徑在合適的范圍內(nèi)（如 50 - 200nm）。隨著多聚賴氨酸偶聯(lián)量的增加，粒徑略有增大，這可能是由于多聚賴氨酸分子的增加導致納米粒子表面增厚。納米粒子表面電位在偶聯(lián)多聚賴氨酸后呈現(xiàn)正電性，且電位值隨著多聚賴氨酸濃度的增加而增大，這有利于與帶負電的質(zhì)粒 DNA 結合。

形態(tài)觀察
TEM 圖像表明，多聚賴氨酸硅納米粒子呈球形，分散性良好，沒有明顯的團聚現(xiàn)象。納米粒子的粒徑與 DLS 測量結果基本一致，進一步證實了制備方法的可靠性。

紅外光譜分析
FT - IR 光譜顯示，在偶聯(lián)多聚賴氨酸后，納米粒子在酰胺鍵特征吸收峰區(qū)域出現(xiàn)了新的吸收峰，這有力地證明了多聚賴氨酸成功地偶聯(lián)到了硅納米粒子上。

（二）體外細胞轉(zhuǎn)染實驗結果

轉(zhuǎn)染效率
熒光顯微鏡觀察和流式細胞術分析結果顯示，多聚賴氨酸硅納米粒子具有一定的轉(zhuǎn)染效率。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著納米粒子濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。與陽性對照組相比，雖然轉(zhuǎn)染效率略低，但在較低的細胞毒性下仍能實現(xiàn)可觀的基因轉(zhuǎn)染。不同分子量的多聚賴氨酸對轉(zhuǎn)染效率也有影響，合適分子量的多聚賴氨酸制備的納米載體轉(zhuǎn)染效率更高，這可能與多聚賴氨酸與質(zhì)粒 DNA 的結合能力以及細胞攝取機制有關。

細胞毒性
MTT 實驗結果表明，多聚賴氨酸硅納米粒子在較低濃度下對細胞的毒性較小。隨著納米粒子濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞存活率有所下降，但在合適的轉(zhuǎn)染條件下，細胞仍能保持較高的存活率。這表明所制備的納米載體具有較好的生物安全性，有利于其在基因治療中的應用。

（三）討論

本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對其體外細胞轉(zhuǎn)染性能進行了研究。結果表明，這種新型納米載體在基因轉(zhuǎn)染方面具有一定的優(yōu)勢。其良好的轉(zhuǎn)染效率可能歸因于多聚賴氨酸與質(zhì)粒 DNA 的有效結合以及硅納米粒子的合適粒徑和表面性質(zhì)，有利于細胞攝取。同時，相對較低的細胞毒性使其在生物醫(yī)學應用中具有更大的潛力。然而，與傳統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)染試劑相比，仍有進一步提高轉(zhuǎn)染效率的空間。未來的研究可以從優(yōu)化納米粒子的制備工藝、進一步調(diào)控表面性質(zhì)以及探索與其他功能分子的協(xié)同作用等方面入手，以進一步提高多聚賴氨酸硅納米載體的轉(zhuǎn)染性能。

四、結論

本研究通過一系列實驗制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對其進行了全面的表征和體外細胞轉(zhuǎn)染實驗。結果顯示，該納米粒子具有合適的粒徑、正電性表面和良好的生物相容性，在體外細胞轉(zhuǎn)染中表現(xiàn)出一定的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性。盡管仍有改進的空間，但本研究為開發(fā)新型、高效、安全的基因載體提供了有價值的參考，有望為基因治療領域帶來新的突破。