白嫩日本少妇做爰,青青草视频在线,2023国精产品一二二线精华液,欧美白人战黑吊

咨詢熱線

15614103871

當前位置:首頁  >  技術文章  >  嗜肺軍團菌免疫原基因真核表達載體構建及功能研究

嗜肺軍團菌免疫原基因真核表達載體構建及功能研究

更新時間:2025-03-12      點擊次數(shù):120

摘要

嗜肺軍團菌免疫原基因的真核表達載體,并驗證其功能。通過PCR擴增目標基因,克隆至某試劑處理的pcDNA3.1載體,利用威尼德電穿孔儀轉染HEK293T細胞,Western blot驗證蛋白表達。免疫熒光及流式細胞術分析顯示,重組質??烧T導特異性免疫應答。結果表明,該載體具備潛在疫苗研發(fā)價值。

引言

嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)是引起軍團菌病的重要病原體,其感染機制復雜,臨床防治亟需高效疫苗。免疫原基因作為疫苗開發(fā)的核心靶點,需通過真核表達系統(tǒng)實現(xiàn)功能性抗原遞呈。目前,針對嗜肺軍團菌的基因疫苗研究仍存在載體表達效率低、免疫原性不足等問題。選取嗜肺軍團菌關鍵免疫原基因(LpIg),構建真核表達載體,通過體外功能實驗驗證其表達特性及免疫激活能力,為后續(xù)疫苗開發(fā)提供理論依據(jù)。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與載體

嗜肺軍團菌臨床分離株由某試劑保存,pcDNA3.1真核表達載體由某試劑提供。

1.2 目的基因擴增與克隆
設計特異性引物(上游:5’-ATGGCG…-3’,下游:5’-CTAGTA…-3’),以細菌基因組為模板,采用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。反應條件:94℃預變性5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1.5 min,共35循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)某試劑純化后,通過威尼德紫外交聯(lián)儀連接至線性化pcDNA3.1載體,轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.3 重組質粒驗證
挑取單菌落擴增后,利用某試劑質粒提取試劑盒提取重組質粒,經(jīng)雙酶切(EcoRI/XhoI)及測序確認插入序列正確性。

1.4 細胞轉染與表達檢測
HEK293T細胞接種于6孔板,密度達80%時,采用威尼德電穿孔儀(參數(shù):電壓250 V,脈沖時間10 ms)轉染重組質粒。轉染48 h后,收集細胞裂解液,通過SDS-PAGE及Western blot(某試劑一抗,HRP標記二抗)檢測目標蛋白表達。

1.5 免疫原性分析
1.5.1 免疫熒光定位
轉染后細胞固定,透膜處理,加入某試劑抗LpIg一抗及FITC標記二抗,威尼德原位雜交儀成像分析蛋白亞細胞定位。

1.5.2 流式細胞術
收集細胞,某試劑PE標記抗體染色,威尼德分子雜交儀檢測表面抗原表達水平。

1.5.3 小鼠免疫實驗
BALB/c小鼠分組注射空載體或重組質粒(50 μg/只),ELISA檢測血清IgG抗體滴度,脾細胞經(jīng)某試劑刺激后,流式檢測CD4+/CD8+ T細胞比例。

結果

2.1 重組質粒構建成功
PCR擴增獲得約1.2 kb的LpIg基因片段,雙酶切及測序證實載體構建無誤。

2.2 蛋白高效表達
Western blot顯示轉染組在約45 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,與預期分子量一致;免疫熒光證實蛋白定位于細胞膜及胞質。

2.3 免疫應答顯著增強
重組質粒免疫組小鼠血清IgG滴度較對照組升高8倍,脾細胞中CD8+ T細胞比例增加至32%,表明誘導了特異性細胞免疫。

討論

LpIg基因真核表達載體,并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)高效表達。威尼德電穿孔儀的高轉染效率為后續(xù)功能研究奠定基礎。Western blot及免疫熒光結果證實,重組蛋白具備正確構象及定位。動物實驗顯示,該載體可同時激活體液與細胞免疫,提示其作為DNA疫苗的潛力。與同類研究相比,載體啟動子區(qū)域,可能提升抗原呈遞效率。

結論

LpIg真核表達載體在體外及小鼠模型中均表現(xiàn)出良好的免疫原性,為嗜肺軍團菌疫苗研發(fā)提供了新策略。未來需進一步優(yōu)化佐劑配伍及攻毒保護實驗驗證其有效性。

參考文獻

1. 奧斯伯,F. M.(Ausubel, Frederick M.),AusubelFrederick M.,金斯頓,R. E.(Kingston, Robert E.),等. 編分子生物學實驗指南 [M].科學出版社,2005.

2. C S, Mintz,P I, Arnold,W, Johnson,等.Antibody-independent binding of complement component C1q by Legionella pneumophila.[J].Infection & Immunity.1995.634939-43.

3. R, Weeratna,D A, Stamler,P H, Edelstein,等.Human and guinea pig immune responses to Legionella pneumophila protein antigens OmpS and Hsp60.[J].Infection & Immunity.1994.623454-62.

4. M S, Hindahl,B H, Iglewski.Outer membrane proteins from Legionella pneumophila serogroups and other Legionella species.[J].Infection & Immunity.1986.5194-101.

5. L H, Gosting,K, Cabrian,J C, Sturge,等.Identification of a species-specific antigen in Legionella pneumophila by a monoclonal antibody.[J].Journal of Clinical Microbiology.1984.201031-5.

 

内射人妻无码色ab麻豆| 性做久久久久久久| 亚洲精品v天堂中文字幕| hd女人奶水授乳milk| 成熟丰满熟妇xxxxx丰满| 国产一区二区三区乱码| 射死你天天日| 高h全肉np放荡日记| 九一九色国产| 岳的大肥屁熟妇五十路99| 国产18禁黄网站免费观看| 韩国理伦三级做爰观看玩物| 午夜成人鲁丝片午夜精品| 极品少妇被猛得白浆直流草莓视频 | 丰满的女房东在线观看6| 午夜精品久久久久久99热| 强壮的公次次弄得我高潮a片日本 夜里十大禁用短视频软件破解版 国产日产久久高清欧美一区 | 99re6在线视频精品免费| 内射人妻无码色ab麻豆| 精品久久久久久中文字幕| 任你躁x7x7x7x7在线观看| 国产真人无码作爱视频免费| 亚洲另类激情综合偷自拍图| 清纯校花挨脔日常h| 无码人妻丰满熟妇区五十路| 少妇被粗大的猛烈进出免费视频| 欧美性大战久久久久久| 国产精品99久久久久久www| 一本加勒比hezyo无码资源网| 四虎成人精品在永久免费| 一个人在线观看的www| 国产精品成人一区二区三区| 国产又猛又黄又爽| 女人高潮叫床污话| 中文乱码人妻系列一区二区| ▇芭乐视频▇在线播放| 中文字幕丰满乱子伦无码专区| av电影在线观看| 亚洲欧美精品无码一区二区三区| 女教师の爆乳bd在线观看 | 18禁黄久久久aaa片广濑美月|