摘要

研究通過整合耐藥表型篩選、質(zhì)粒分離及基因定位分析，系統(tǒng)探討了腸桿菌科細菌中碳青霉烯酶基因的質(zhì)粒攜帶特征及其遺傳環(huán)境。實驗采用威尼德電穿孔儀完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，結(jié)合高通量測序技術(shù)解析基因上下游結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，blaKPC-2基因主要位于IncF型質(zhì)粒上，其側(cè)翼存在可移動遺傳元件，表明質(zhì)粒介導的耐藥基因傳播風險較高。

引言

碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥腸桿菌科感染的最后防線，但其耐藥性在全球范圍內(nèi)持續(xù)加劇。碳青霉烯酶基因（如blaKPC、blaNDM）的質(zhì)粒定位是介導耐藥性水平轉(zhuǎn)移的核心機制，然而基因的遺傳環(huán)境多樣性及質(zhì)粒載體特征仍需深入解析。研究以臨床分離的耐碳青霉烯腸桿菌科細菌為對象，通過質(zhì)粒分離、基因定位及遺傳結(jié)構(gòu)分析，揭示碳青霉烯酶基因的傳播潛能與進化規(guī)律，為耐藥防控提供理論依據(jù)。

實驗部分

1. 菌株篩選與耐藥表型分析
收集臨床分離的腸桿菌科細菌共150株，采用某試劑（碳青霉烯類抗生素）通過微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）。通過PCR擴增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48），篩選出陽性菌株42株。耐藥菌株在含某試劑（4 μg/mL亞胺培南）的MH瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，驗證穩(wěn)定性。

2. 質(zhì)粒分離與基因定位
采用堿裂解法提取菌株質(zhì)粒，經(jīng)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選獲得攜帶碳青霉烯酶基因的重組菌。通過Southern blot驗證質(zhì)粒攜帶情況：質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后轉(zhuǎn)移至尼龍膜，使用威尼德紫外交聯(lián)儀固定DNA，以digaoxin標記的blaKPC探針進行雜交，顯影后確認目標基因的質(zhì)粒定位。

3. 質(zhì)粒分型與遺傳環(huán)境解析
對陽性質(zhì)粒進行全基因組測序（某品牌測序平臺），通過生物信息學工具注釋質(zhì)粒復(fù)制子類型（IncF、IncN等）及耐藥基因上下游序列。利用威尼德分子雜交儀進行基因簇共定位分析，識別插入序列（IS）、轉(zhuǎn)座子及整合子等可移動元件。

4. 接合轉(zhuǎn)移實驗
以威尼德原位雜交儀監(jiān)測接合過程：供體菌（耐藥株）與受體菌（敏感大腸桿菌J53）在LB液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，通過抗性平板篩選接合子，計算轉(zhuǎn)移頻率。接合子經(jīng)PCR驗證碳青霉烯酶基因的獲得。

5. 遺傳穩(wěn)定性評估
將重組質(zhì)粒連續(xù)傳代30次，每5代檢測bla基因保留率及質(zhì)粒拷貝數(shù)變化，使用某試劑（實時熒光定量PCR試劑盒）分析基因表達水平。

結(jié)果與討論

1. 耐藥表型與基因分布
42株陽性菌中，blaKPC-2占比67%（28/42），blaNDM-1占比26%（11/42）。亞胺培南MIC值范圍32-128 μg/mL，與基因型高度相關(guān)。

2. 質(zhì)粒載體特征
Southern blot證實82%的bla基因位于質(zhì)粒上，其中IncFII型質(zhì)粒占主導（58%）。接合轉(zhuǎn)移實驗顯示，IncF型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率（10?3/供體菌）顯著高于其他類型，提示其傳播優(yōu)勢。

3. 遺傳環(huán)境解析
blaKPC-2基因上游普遍存在ISKpn27轉(zhuǎn)座酶，下游為ISKpn6，形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)；blaNDM-1則與bleMBL抗性基因共定位，兩側(cè)由ISAba125元件包圍?？梢苿釉拿芗植急砻骰蛩睫D(zhuǎn)移的活躍性。

4. 儀器性能評價
威尼德電穿孔儀（轉(zhuǎn)化效率＞10? CFU/μg DNA）與紫外交聯(lián)儀（紫外強度誤差＜2%）顯著提高了實驗重復(fù)性，分子雜交儀的自動化溫控功能避免了非特異性結(jié)合。

結(jié)論

證實碳青霉烯酶基因在腸桿菌科細菌中主要依賴IncF型質(zhì)粒傳播，其遺傳環(huán)境富含可移動元件，加劇了耐藥性擴散風險。威尼德系列儀器在質(zhì)粒操作與基因定位中展現(xiàn)出高精度與穩(wěn)定性，為耐藥機制研究提供了可靠技術(shù)支撐。研究結(jié)果為臨床監(jiān)測與藥物開發(fā)提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

參考文獻

1. 陳照強,劉一方,朱寧,等.金屬β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊）.2011,(3).

2. 張嶸,蔡加昌,胡云建,等.IMP-4型金屬β內(nèi)酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素高水平耐藥[J].中華檢驗醫(yī)學雜志.2010,(9).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2010.09.009 .

3. 李軼,馮羨菊.河南發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[J].中華檢驗醫(yī)學雜志.2009,(9).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.09.019 .

4. 湯瑾,蔣燕群,李卿,等.一例碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌耐藥機制研究[J].檢驗醫(yī)學.2009,(5).DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2009.05.009 .

5. 王彩虹,陳堅,郭杰,等.質(zhì)粒介導KPC-2型碳青霉烯酶弗勞地檸檬酸鹽桿菌的研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志.2009,(11).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.11.007 .

6. 蒯守剛,邵海楓,王衛(wèi)萍,等.大腸埃希菌質(zhì)粒型碳青霉烯酶KPC-2檢測和分析[J].中華檢驗醫(yī)學雜志.2009,(10).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.10.008 .